作者姓名：刘先博，刘 奕
基金项目：辽宁省重点研发指导计划项目（JH8/）；沈阳市科学技术计划项目（20--4-）
作者单位：中国医科大学口腔医学院·医院正畸教研室，辽宁省口腔疾病重点实验室，辽宁沈阳
通信作者：刘奕，电子信箱：liuyi
cmu.edu.cn摘要：外泌体是细胞分泌的纳米级囊泡，广泛存在于各类体液中。外泌体携带的多种生物活性物质可以在细胞间进行传递，从而影响机体生理和病理状态。在疾病的发生发展过程中，外泌体的含量和内容物常发生改变，且外泌体可以反映其来源细胞的特性。基于外泌体的独特性质，越来越多的研究人员将其作为理想的生物标志物，用于疾病的早期诊断及预后监测。目前，基于光学和非光学原理开发了多种技术手段用于分析疾病相关外泌体。文章就外泌体检测相关技术及其在口腔疾病诊断中的应用做一阐述。
关键词：外泌体；早期诊断；检测
外泌体（exosomes）是细胞分泌的具有脂质双分子层的纳米级囊泡，可以携带蛋白质、脂类、核酸等，并将其传递至受体细胞。近年来的研究显示，外泌体通过在细胞间传递其携带的生物活性物质，在多种生物学过程中发挥重要作用。在某些疾病如肿瘤、阿尔兹海默病的早期，血清中的外泌体含量即可发生改变，且外泌体的双层膜结构可以防止其内容物被酶类物质降解，使外泌体具有更高的稳定性。因此，将外泌体作为疾病筛查、早期诊断、预后监测的标志物，具有广阔的应用前景。
1 外泌体概述
外泌体是细胞分泌的含有蛋白、核酸和脂类等生物活性分子的纳米级囊泡［1］，在透射电镜下呈现双凹碟形或杯状形态［2］，直径为30~nm，密度为1.13~1.19g/mL［3-4］。外泌体具有脂质双分子层结构，膜上镶嵌有脂阀和多种蛋白，包括外泌体的管家蛋白及不同细胞来源外泌体的特异性蛋白；膜内则含有各类核酸，包括DNA、RNA、miRNA等，一些蛋白和脂类同样可以包裹到外泌体中。人体内几乎各类细胞均可分泌外泌体，并富集到体液中，如血液、乳汁［5］、尿液［6］和唾液［7］等。细胞分泌的外泌体可以携带其来源细胞自身的蛋白质、核酸等物质，执行细胞间物质的运输，参与细胞间通信并介导下游信号通路。如肿瘤细胞分泌的外泌体，可以改变肿瘤微环境，促进血管生成及肿瘤的侵袭和转移［8］；骨髓间充质干细胞来源的外泌体，通过上调受体细胞中成骨基因Runx2、OCN、ALP、BSP和Col-I的表达，提高牙周膜干细胞的体外增殖和成骨分化能力，进而促进牙周再生［9］。
除了参与机体内的多种生物学过程，外泌体作为疾病的生物标志物同样具有巨大的潜力。为了解决外泌体检测及分离过程中的问题，研究人员基于光学、电化学和电生物传感器等原理开发了多种分析检测方法，下文就外泌体分析检测技术的发展状况做一概述。
2 外泌体检测相关技术
2.1 纳米颗粒追踪技术（nanoparticletrackinganalysis，NTA） NTA是近年来新兴的可以对外泌体进行表征的光散射技术［10］。其原理为纳米级的外泌体可在其悬液中进行无规则的布朗运动，当激光对外泌体的悬液进行照射时，所产生的散射光可被装有镜头的显微镜所接收，根据Stokes-Einstein方程，并结合悬液的温度和黏度，计算出外泌体的密度和粒度分布［11］。NTA可以对悬液中直径为50~nm的颗粒进行检测，且具有较高的分辨率。同时NTA可以实现对单个样品的可视化和计数。因此，NTA已被广泛地用于外泌体定量研究中。Dragoivc等［12］研究并对比了NTA与流式细胞术（flowcytometry，FCM）对外泌体检测的效率，结果显示，NTA可以对直径50nm的囊泡进行分析，相比于FCM，具有较高的灵敏度；且与电子显微镜和原子力显微镜相比，NTA还能够分析相对较多数量的囊泡。尽管在基础研究中NTA应用广泛，但是在临床样本中检测外泌体方面有很大的局限性。这些限制是由于在数据获取过程中涉及冗长的程序。具体来说，FCM可以在不到1s的时间内分析个颗粒，而NTA通常需要10min，长时间的分析也会导致荧光染料的猝灭；此外，NTA不能分析外泌体的组成成分，在对外泌体进行分析定量时，并不能对外泌体进行特异性定量；最后，NTA在激光对悬液激发时，悬液中脂蛋白颗粒和蛋白聚集体所产生的散射光可能会对外泌体的测定造成干扰，故在应用NTA进行量化前，需要对外泌体进行纯化。
2.2 FCM与流式细胞荧光分选技术（fluorescenceactivatedcellsorting，FACS） FCM是利用激光对处在快速直线流动状态的单细胞进行照射，照射到的细胞发生散射和折射，散射光被检测器转换为电信号，再经过电脑数据处理，即可对细胞进行分析或分选。FCM是一种成熟的技术，可以用于外泌体的高通量分析及定量，其基本原理是记录液体中悬浮的单个外泌体的激发荧光和散射光。但是，传统的FCM有一定的局限性，其中最主要的是不同检测平台间的数据解读存在差异。这种差异是由于不同流式细胞仪有不同的光学系统，不同光学系统的灵敏度存在差异。由于外泌体的折射率较低，因此获得的散射光也比相似体积颗粒的散射光强度低。这就需要我们在应用FCM检测外泌体时，确定标准化的检测规范。而且传统流式细胞仪检测的颗粒直径一般为~nm，则其他大小的外泌体并不能被检测。因此，研究人员将FCM与免疫荧光方法相结合，通过对外泌体等囊泡的荧光标记来检测其来源，并将其进行分类。
流式细胞荧光分选技术（fluorescenceactivatedcellsorting，FACS）是一种特殊类型的FCM，可以将荧光标记的外泌体进行分选。与传统的FCM相比，该技术相对复杂，需要在分选前使用含有荧光染料的特定抗体对外泌体进行标记，以便利用其特定的激发光进行捕获和分选。近年来，越来越多研究人员开始利用FACS进行外泌体的分析。Rim等［13］使用FACS检测了小鼠肺癌细胞来源外泌体，首先通过CD9或CD63包被的磁珠进行外泌体捕获，随后利用外泌体荧光标签进行标记，最后应用FACS进行外泌体分析。然而，该方法对外泌体进行分析时，操作步骤较多，且对抗体的特异性要求较高。但随着技术的革新，研究人员研发出高灵敏度纳米流式细胞仪。Pospichalova等［14］使用这种高灵敏度纳米流式细胞仪，成功地对细胞上清液及患者腹水中的外泌体进行了检测，其可对直径为80nm的小颗粒进行检测，并拥有10nm的高分辨率。因此，这种纳米级高灵敏度流式细胞仪，在今后的外泌体研究中，会有广阔的应用前景。
2.3 表面等离子共振技术（surfaceplasmonresonancetechnology，SPR） SPR检测外泌体的原理为：入射光射到结合有外泌体的金属表面后检测反射光的角度，若反射光在一定程度内消失，此时的入射光角度为SPR角。SPR角随表面折射率的变化而改变，而折射率随结合在金属表面外泌体的数量而改变。因此，可以通过SPR角的变化对外泌体进行定量检测［15］。基于SPR的纳米传感器对外泌体的定量检测，可以实现无标记的实时检测，且具有较高的信噪比，生物相容性也较好。但是，在应用过程中该方法也有其局限性：当外泌体双层膜结构发生改变时，会导致折射率发生改变，影响检测的准确性；且SPR芯片的使用次数有限。
2.4 酶联免疫吸附测定技术（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA） ELISA作为经典的免疫学技术，其将抗原抗体反应特异性与酶促反应相结合，广泛应用于蛋白质鉴定、浓度检测、抗体滴度分析等。一般来说，基于ELISA的检测方法，通常是将外泌体直接包被于微孔板上并进行封闭处理，再利用外泌体标志物CD9、CD63作为识别抗体来结合外泌体，最终通过辣根过氧化物酶-二抗催化显色底物TMB来进行定量。但是，基于ELISA对复杂体液中的外泌体进行检测时，可能会由于非特异性吸附的原因，造成检测结果的背景信号较高。
2.5 生物传感器技术 传感器是一种检测装置，其能够感受外界的信号、物理条件或化学组成，并将探知的信息进行储存或传输。而生物传感器（biosensor）是一种对生物物质敏感，并将其含量转换为电信号进行检测的仪器，具有准确度高、特异性强、成本低等特点。生物传感器技术在外泌体的检测中也表现出广阔的应用前景。Xia等［16］设计了单层碳纳米管与核酸适配体相结合的传感器，该方法将碳纳米管底物催化能力与适配体特异性识别外泌体能力相结合，当外泌体与核酸适配体结合时，碳纳米管构象改变，对底物TMB催化能力改变，通过底物颜色改变对外泌体进行检测。此方法不需要对外泌体进行标记就可完成检测工作。Jeong等［17］设计了集成化的电化学传感器，该方法首先通过免疫磁珠对外泌体进行捕获，后利用酶标抗体与捕获到的外泌体结合，通过酶对底物的催化来放大信号，进而对外泌体进行检测。该方法具有高灵敏性，并可以对细胞特异性外泌体进行检测，且该传感器实现了集成化，可以实现高通量的检测。
2.6 可调电阻脉冲感测（tunableresistivepulsesensing，TRPS）技术 近年来，研究人员开发了基于TRPS为原理的商品化新型检测系统qNano，其可以对纳米粒子进行定量［18］。该仪器将可调式纳米孔洞薄膜与电阻脉冲感应器相结合，通过调控纳米孔洞的大小来控制粒子的进出，可对单一粒子的直径、分布和浓度进行分析计数。TRPS技术可以对直径为70~0nm的颗粒进行实时监测，并对悬液中的单个颗粒进行检测。年，Sina等［19］与Yadav等［20］均报道，在利用SPR对乳腺癌细胞来源外泌体进行定量前，可以应用TRPS技术对外泌体进行表征。但对于外泌体的来源分析，TRPS技术并不能提供相关信息。
2.7 微流控技术 近几十年来，越来越多的研究人员将微流控（microfluidic）技术运用在生物医学的研究中［21］。微流控系统可以对微小体积的样品和反应体系进行操控，且可以对物质进行分离和检测，具有反应快速、节约试剂的优势。自年以来，已开发出不同类型的基于微流控技术的检测平台，以期对外泌体进行检测。Chen等［22］报道，应用微流控技术在芯片的通道中包被CD63抗体，并对人血清中的外泌体进行捕获。He等［23］应用微流控技术，开发出可以在芯片上原位对患者血浆中的外泌体进行直接检测，其可以在一个芯片上对体液中的外泌体进行分离和富集，再将ELISA与荧光技术结合，对外泌体进行检测，该方法已成功地用于非小细胞肺癌患者血浆中外泌体的检测。Wang等［24］开发了一种微流控系统，该系统由许多微柱构成，并存在多孔的硅纳米线结构。该系统可以对类外泌体的脂类囊泡进行捕获，并可以过滤掉蛋白及细胞碎片；其捕获到的囊泡可用PBS溶解，并通过多孔的硅纳米线结构进行回收。
2.8 其他 Vaidyanathan等［25］基于可调交流电流体的方法，对乳腺癌细胞来源外泌体进行高灵敏度捕获并检测。Ueda等［26］建立了一种抗体修饰的集成硅探针，可以对复杂的临床样品中的外泌体进行快速且可重复的提取，并使用该方法对46例肺癌患者血清样品中的外泌体进行了检测。Yoshioka等［27］通过抗体对结直肠癌患者血清中外泌体进行捕获后，利用光敏感磁珠对外泌体进行检测，该方法可以直接检测样品中的外泌体，无需对外泌体进行传统的纯化处理。
3 外泌体检测在口腔疾病诊断中的应用
3.1 口腔颌面部肿瘤早期诊断与预后监测 口腔颌面部肿瘤的早期诊断对患者的预后具有重大意义。传统的组织活检虽可以确诊，但存在一定手术风险。近年来，针对循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、外泌体等的液体活检技术逐渐兴起。Zlotogorski-Hurvitz等［28］利用原子力显微镜及ELISA对健康人群和口腔癌患者的口腔体液中的外泌体进行检测；原子力显微镜观察发现，与健康人群外泌体相比，口腔癌患者外泌体具有更高的密度；ELISA结果显示，口腔癌来源外泌体的CD81和CD9表达水平较低，而CD63表达更高。上述结果提示，在尚未出现临床可见的病变前，可以将外泌体作为疾病早期诊断的生物标志物，同时外泌体也可以作为癌症预后的监测指标。
3.2 正畸牙移动 龈沟液是牙龈结缔组织渗入到龈沟内的液体。在正畸牙移动时，龈沟液中的细胞外囊泡的成分和含量可能发生改变。Holliday等［29］利用NTA、ExoView和微流控芯片等手段，检测了在正畸牙移动过程中龈沟液中的外泌体，结果发现，核因子-κB受体活化因子（RANK）和RANK配体（RANKL）在正畸牙移动模型中的压力侧和张力侧表达水平存在差异。龈沟液的提取技术成熟，且与唾液相比，龈沟液更能反映特定牙齿邻近牙周组织的情况。因此，将正畸牙移动时龈沟液中的外泌体作为骨改建及牙根吸收的生物标志物，可以帮助正畸医生早期发现并治疗患者的骨吸收及牙根吸收。
3.3 口腔黏膜病 口腔黏膜病种类繁多，表现多样。某些口腔黏膜病的口腔表征可作为全身疾病诊断的依据。其中口腔扁平苔藓（OLP）作为WHO认定的口腔潜在恶性疾病，其早期诊断尤为重要。Peng等［30］利用miRNA微阵列芯片对OLP患者血浆中外泌体miRNA进行检测发现，OLP患者某些miRNA表达上调，且与疾病的严重程度相关。因此，血浆中外泌体可作为生物标志物，有望替代传统活检对OLP进行早期诊断。此外，研究人员还发现舍格伦综合征患者唾液中外泌体成分同样发生了改变。Aqrawi等［31］利用液相色谱-质谱（LC-MS）的手段，分析舍格伦综合征患者唾液及泪液中的外泌体，发现多种与免疫相关的蛋白表达水平发生改变。收集舍格伦综合征患者唾液及泪液的过程是无创的，且LC-MS检测所需的样品量少，检测结果精确，因此外泌体可以作为舍格伦综合征早期诊断及预后监测的标志物。
3.4 牙周疾病 牙周病是口腔常见的疾病。患者的全身因素及口腔局部因素都有可能对疾病的发生发展造成影响，且牙周致病菌也可以分泌细菌的外膜囊泡。因此，对患者口腔体液中的外泌体或细菌外膜囊泡进行检测，以期成为诊断的标志物，就显得尤为重要。Tobón-Arroyave等［32］利用ELISA对牙周炎患者唾液中的外泌体进行检测，发现牙周炎患者唾液外泌体标志物CD9与CD81的比值降低。Han等［33］利用透射电镜和NTA对唾液中外泌体进行检测，并利用RT-PCR技术对特定核酸进行检测，发现健康人群和牙周炎患者的唾液中外泌体在形态、尺寸及粒径分布上差别不大；但牙周炎患者唾液中某些特定miRNA表达升高，表明唾液中外泌体miRNA可作为牙周炎早期诊断及预后监测的生物标志物。某些牙周致病菌也可以通过分泌外膜囊泡影响牙周炎的发展。Choi等［34］发现牙龈卟啉单胞菌、齿密垢螺旋体等可以产生类似miRNA的小RNA（miRNA-size、smallRNAs或msRNAs），并经由细菌的外膜囊泡递送到牙周组织，抑制人外周血白血病T细胞相关细胞因子的表达。
4 小结
外泌体作为疾病的生物标志物具有广阔的临床应用前景。尽管，目前外泌体分离检测技术的研究水平得到提高，但并没有一种可以通用于所有疾病的检测方法。在对临床样品进行检测时，减小正常细胞分泌的外泌体对疾病特异性外泌体的干扰，是目前需要解决的问题；同时疾病特异性外泌体及其携带的内容物也可能会存在异质性，同样也可能影响分析结果。因此，选择合适的外泌体检测方法及适合的外泌体标志物是至关重要的。相信随着技术的进步及研究水平的提高，外泌体的检测方法会有新的发展，这将更有助于研究外泌体的生物学意义，为外泌体在口腔临床中广泛应用提供依据。
参考文献略
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